Hidrogeles de Formación,drogeles tri-Dimensionales: Fuentes Potenciales para la Regeneración de Cartílago Articular

Resumen

Las lesiones condrales focales y la artrosis afectan a un significante cantidad de pacientes activos. Los tratamientos quirúrgicos disponibles mejoran la calidad de vida de la mayoría a mediano plazo; sin embargo, la progresión hacia la artrosis prematura se encuentra latente. Un llamado a tratamientos biológicos con capacidad de restaurar la lesión es crucial. La bioingeniería constituye un área para la regeneración de cartílago que potencialmente podría progresar en el terreno de tratamientos articulares, promoviendo regeneración y evitando degeneración. Las células madre e hidrogeles pueden proveer un tejido biológico funcional equivalente de comportamiento dinámico que induce regeneración y reemplaza el tejido dañado. El abordaje consiste en colocar un hidrogel precursor o un biomaterial tri-dimensional impreso dentro del defecto para inducir regeneración. Esta revisión se focaliza en el uso actual y a futuro de hidrogeles y bioimpresión tri-dimensional para la regeneración de cartílago articular en el tratamiento de lesiones condrales focales.

Abstract

Focal chondral lesions and osteoarthritis affect a significant number of active patients. Surgical available treatments improve quality life of most at mid-term; however, progression towards premature osteoarthritis is latent. A call on less invasive and disease progression modifying biological treatments is substantial. Bioengineering constitutes a possible solution for cartilage regeneration that could potentially advance the field for the treatment of both focal chondral lesions and early osteoarthritis, promoting regeneration and preventing degeneration. Stem cells and hydrogels may provide a functional biological equivalent tissue of dynamic behavior to induce regeneration and replace the damaged tissue. The standard approach consists in delivering cells within a hydrogel or a three-dimensional biomaterial printed scaffold into the affected tissue to induce regeneration. This review focuses on the current and future use of hydrogels and scaffold bioprinting for articular cartilage bioengineering in the treatment of focal chondral lesions.

Introducción

La población joven y activa es la más expuesta a lesiones articulares de cartílago. Frecuentemente ocurren tras un trauma o asociadas a otras patologías, incluyendo las lesiones ligamentarias, el pinzamiento articular o la inestabilidad articular. La bibliografía revela que las lesiones de cartílago articular son más comunes en atletas y pacientes activos que en la población en general (1) (2). La mayoría de estas lesiones progresan hacia la artrosis, si no son tratadas prontamente (3)(4). Jones et al. (5), en un estudio longitudinal de 395 pacientes adultos, señalaron los factores de riesgo asociados, como son el alto índice de masa corporal (BMI) y el sexo femenino. Además, ciertos deportes parecen tener una mayor predisposición para la artrosis, como el fútbol, lucha, corredores de largas distancias, deportes de contacto y levantamiento de pesas (6). Los trataminetos quirúrgicos para las lesiones de cartílago han avanzado desde la microfractura hacia el transplante celular e implantes osteocondrales viables. Aunque ninguna de estas terapias permite la regeneración de cartílago hialino normal y nativo y la gran mayoría de las lesiones condrales se recuperan con la formación de fibrocartílago, poco apto para el rendimiento natural de la superficie articular. La ingeniería tisular podría proveer una herramienta terapéutica que avanzaría en el terreno permitiendo una recuperación más rápida de los pacientes y mejor regeneración del cartílago articular (7)(8). La revisión que efectuamos está enfocada al uso de hidrogeles para la ingeniería de cartílago articular y su potencial uso combinados con células madre para el tratamiento de lesiones condrales focales y la artrosis temprana.

Bioingeniería tisular

La bioingeniería tisular ha demostrado capacidad, por medio de tejidos biológicos funcionalmente equivalentes y de comportamiento dinámico, para iniciar y conducir la regeneración de tejido dañado o perdido. El abordaje estándar para la bioingeniería de tejidos es combinar células con hidrogeles o estructuras tri-dimensionales (3D) de biomateriales y ayudar a regenerar el tejido dañado. La estructura 3D es diseñada para crear un microambiente que asemeja tejidos específicos y estimula regeneración nativa por promoción de interacciones célula-matriz e intercelular que pueden orquestar hacia la diferenciación celular dirigida y crecimiento tisular específico (9)(11).

Múltiples plataformas han sido estudiadas para la bioingeniería de cartílago. Entre estas, los hidrogeles biodegradables se han propuesto como una plataforma prometedora. Una ventaja principal del uso de hidrogeles es su propiedad para inyectar una solución líquida de precursores de hidrogel y luego polimerizarla in vivo para formar el hidrogel. La polimerización in situ permite una mayor adhesión entre el hidrogel y el tejido circundante. Además, avances recientes en bioimpresión han garantizado la habilidad para ensamblar hidrogeles en formas tisulares anatómicamente funcionales o en partes de órganos. En adición, los hidrogeles pueden usarse como sistemas de liberación de drogas, permitiendo una liberación controlada y sostenida de forma intraarticular por semanas y meses (12) para el tratamiento de enfermedades articulares inflamatorias como la artrosis o la artritis reumatoide.

La bibliografía sobre ingeniería tisular en cartílago articular, realizada en modelos animales, ha crecido mucho en los últimos años; sin embargo, el 90 % de los nuevos abordajes con éxito en animales eventualmente fallan en los ensayos clínicos (13). Por ende, se requiere de un meticuloso análisis de los resultados clínicos a corto plazo. Este enfoque riguroso es necesario para guiar el desarrollo de abordajes biomiméticos y bioactivos en ingeniería tisular, que liderará hacia resultados clínicos más exitosos y confiables.

Comportamiento de los hidrogeles

Los hidrogeles son polímeros reticulados insolubles, que se hidratan en medios acuosos. El alto contenido de agua de los hidrogeles puede ser calibrado, alcanzando valores similares al cartílago nativo (~80%) y aun más (ej, >90% agua), el cual facilita un rápido intercambio de nutrientes y desechos de forma centrípeta y centrífuga de las células embebidas (7). Los hidrogeles pueden ser divididos en polímeros reticulados naturales o sintéticos, o una combinación de ambos (14). Los polímeros naturales están favorecidos por su biocompatibilidad general y, en algunos casos, por su similitud bioquímica con cartílago nativo y su facilidad para ser degradados por enzimas celulares. Algunos ejemplos de polímeros naturales usados como hidrogeles, en la ingeniería tisular de cartílago, incluyen colágeno, fibrina, alginato, hialuronano, ceda, y quitina (15). Los polímeros sintéticos están favorecidos por su alta maleabilidad, permitiendo un mayor control sobre las propiedades macroscópicas y su degradación. Algunos ejemplos de polímeros sintéticos que han sido usados en ingeniería tisular de cartílago incluyen polietilenglicol (PEG) y alcohol de polivinilio (PVA), entre otros. Notablemente, hidrogeles formados de polímeros sintéticos diseñados para tener propiedades mecánicas similares a las de cartílago articular (16)(17). Es más, ciertos estudios han demostrado la habilidad para embeber células y factores de crecimiento en hidrogeles sintéticos (18-24). La combinación de polímeros sintéticos y naturales ha emergido como un abordaje prometedor para crear hidrogeles biomiméticos que pueden diseñarse para mimetizar aspectos clave del ambiente nativo, mientras se ajustan las propiedades mecánicas, químicas y degradativa del hidrogel (25-30).

Un hidrogel ideal soporta cargas en la articulación, se degrada gradualmente y transfiere el estimulo mecánico al nuevo tejido en formación. Es importante ajustar y equilibrar la degradación con los tiempos del nuevo tejido en crecimiento. El ritmo de degradación del hidrogel depende del grado de reticulado (ej, a mayor reticulado más lenta la degradación será) y la elección del enlazador degradable, el cual influencia la velocidad de degradación. El desafío es que una alta densidad de reticulado es requerida para soportar carga en la articulación, pero enlentecerá la degradación y afectará negativamente la difusión de moléculas grandes, incluyendo factores de crecimiento y moléculas nuevas de matriz extracelular (MEC) sintetizadas. Es de notar, que las moléculas de MEC, especialmente agrecano y colágeno, son demasiado grandes para ser transportadas a través del reticulado del hidrogel y como resultado la degradación debe ocurrir antes de que se forme un tejido (19)(31)(32). Es posible emparejar la degradación con el crecimiento de nuevo tejido, si cuidadosamente se ajustan las propiedades iniciales y la formula del hidrogel. Esto se ha obtenido usando hidrogeles susceptibles a hidrólisis (33)(34) y a enzimas que son secretadas por células encapsuladas (ej, metaloproteinasas y agrecanasa) (35)(36). Sin embargo, el desafío está en que estos hidrogeles degradables que han alcanzado crecimiento tisular macroscópico tengan un módulo compresivo inicial de uno a dos órdenes de magnitud por debajo del cartílago. Por lo tanto, el desafío persiste en diseñar un hidrogel que soporte carga articular y facilite crecimiento tisular de forma simultánea.

Otro parámetro crítico cuando se quiere diseñar un hidrogel para la formación de cartílago in vivo es obtener una integración óptima con el tejido circundante. Inicialmente, el hidrogel necesita adherirse al tejido circundante. Esto se puede obtener por polimerización in situ directamente en el defecto y mejorado con un adhesivo (37). El fenómeno de integración funciona a modo de ”nexo” entre el tejido biomimético y la superficie del defecto, permitiendo a las células migrar hacia afuera de la plataforma o hidrogel, o hacia adentro desde el tejido circundante (38). Sin una eficiente integración, el hidrogel y tejido diseñado no podrán transferir la carga apropiadamente y como resultado, aparece solución de discontinuidad entre el tejido circundante o lesión a tratar y el tejido biomimético, por ende potencial falla de implante (15).

Nuestro equipo ha desarrollado y analizado un hidrogel basado en un reticulado de PEG, en el que se han introducido análogos de MEC, condroitín sulfato (CS) y ácido de arginina-glycina-aspartico (RGD), para crear un hydrogel biomiméticamente similar al cartílago (39) (Figura 1). El CS es el principal glicosaminoglicano y crea un microambiente hiperosmótico y promueve síntesis tisular, bajo compression dinámica (40-42). Por otro lado, el RGD, es un péptido para la adhesión celular que provee que las células censen la rigidez del substrato y actúa como un mecano-sensor para la compresión dinámica (43). Este mismo ha demostrado soportar la condrogenesis (44)(45) y a concentraciones bajas mejora la diferenciación celular (45). Este precursor de hidrogel es fotopolimerizable con luz ultravioleta (UV), por lo cual los diferentes componentes se modifican con grupos que reaccionan y pueden entrelazarse entre sí, formando un polímero entrelazado ante la exposición de luz UV (Figura 1). Además, este hidrogel permite la encapsulación de células durante su formación, siendo la combinación formada in situ en el defecto a tratar (Figura 2 ). Las ventajas incluyen el control temporal y espacial durante la formación del hidrogel, la habilidad de polimerizarlo a pH y temperatura fisiológica y de forma rápida, de segundos a minutos (46).

En un estudio sobre el CPG (en prensa), este mismo hidrogel, ha tenido resultados prometedores para reparar lesiones condrales críticas e inducidas de 3 mm en conejos blancos adultos de Nueva Zelandia. El grupo tratado con hidrogel obtuvo mejor condrogénesis y se integró parcialmente al cartílago adyacente a los 6 meses (Figura 3) (Figura 4). Además, el hidrogel puede ser formado creando múltiples capas que reproducen capas nativas de tejidos que serán regeneradas en las lesiones osteocondrales combinadas. Previamente hemos demostrado una secuencia simple de fotopolimerización usando una versión estable, es decir no degradable, de hidrogeles a base de PEG cambiando el tipo y concentración de análogos de MEC, como también la rigidez local dentro de cada capa. Notablemente, bajo carga compresiva, la variación en la rigidez del hidrogel dentro de cada capa produjo alta tensión en la capa blanda (similar al cartílago símil), baja tensión en la capa rígida (similar al hueso) y tensión moderada en la interfaz. Esto permitió la posibilidad de dirigir la diferenciación de células madre embebidas en el hidrogel (47). En vista a tratar lesiones complejas que involucran distintos tejidos, es posible combinar diferentes nichos de células madre e hidrogeles para guiarlas hacia la diferenciación deseada.

Fuentes celulares

La utilización de células en hidrogeles puede resultar en una regeneración del cartílago hialino más rápida y robusta (7). Hay un gran número de células que han sido probadas en la reparación de cartílago y pueden ser divididas según su nivel de diferenciación: condrocitos completamente diferenciados o células madre indiferenciadas (pluripotentes o multipotentes).

Condrocitos

Los implantes de condrocitos autólogos (ACI) han sido usados por décadas en el tratamiento de lesiones condrales focales, con buenos resultados clínicos (48-51). La tercera generación de ACI, o implantes de condrocitos autólogos matriz-inducida (MACI) han incorporado plataformas para prevenir la desdiferenciación de condrocitos durante cultivo y potenciar esta técnica (52-55). La mayoría de las plataformas para MACI consisten de colágeno tipo I o III, o ácido hialuronico (54)(55). Encontrando buenos resultados clínicos, a largo plazo, con la técnica de MACI para el tratamiento de lesiones condrales focales de rodilla (56)(57). A pesar de estos resultados, las limitaciones de estos procedimientos incluyen morbilidad relacionada al sitio de extracción de las células y las bajas probabilidades de regeneración en pacientes mayores de 50 años. Debido a la merma en la capacidad de proliferación celular y secreción de matriz extracelular de los condrocitos con el aumento de la edad del donante (3)(58). Esto impulsó la investigación de otras fuentes celulares, principalmente las células madre.

Células madre

Diferentes fuentes de células madre han demostardo su habilidad condrogénica in vitro y la reparación de cartílago articular en modelos animales. Estas incluyen células madre embrionarias (ESCs), células madre mesenquimales (MSCs) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) (59).

Las ESCs pueden se cosechan de embriones en sus primeros estadíos (60) y poseen una capacidad ilimitada de autorenovación y, simultáneamente, mantienen diferenciación potencial pluripotente (61). Esto les permite diferenciarse a cualquier célula del cuerpo, incluyendo condrocitos. La combinación de estas células con hidrogeles biomiméticos y factores de crecimiento (ej, factor de crecimiento transformante beta-1, proteína morfogénica ósea) forman un microambiente sinérgico para su condrogénesis (9)(62-66). Cuando las ESCs humanas son embebidas en diferentes hidrogeles (hialuronano, fibrina, PEG) para tartar lesiones condrales focales inducidas de rodilla en ratas, se obtuvieron mejores resultados que utilizando de hidrogel solo (67-69).Esta fuente presenta problemas éticos por lo que su uso se ha desechado (60)(70). Esto ha promovido un interés en las células madre derivadas del adulto, como ser las MSCs. Las MSCs, son una población multipotente y precursora de cartílago que puede ser obtenida de tejidos adultos como médula ósea (71), tejido sinovial, tejido adiposo, periostio, como también cordón umbilical y sangre periférica entre otros (72)(73). Algunos estudios in vitro han reportado diferenciación condrogénica de MSCs cuando estas son sembradas en hidrogeles 3D, como agarosa, hialuronano, PEG o alginato (74)(75). A su vez, numerosos estudios en animales pequeños han tenido resultados alentadores con la utilización de esta combinación en el tratamiento de lesiones osteocondrales de rodilla (76-79). La utilización de MSCs incorporados a moldes de fibrina para tratar defectos condrales de rodilla en caballos, formaron tejido óseo (80). Debe notarse que la capacidad de proliferación y diferenciación de las MSCs in vitro disminuye con la edad y el envejecimiento (81-85), disminuyendo su uso en pacientes mayores. Por eso, los métdos para mejorar la condrogénesis de las MSCs podrían ser alcanzados a través del usos de hidrogeles. Los cuales pueden proveer de fuertes señales condrogenicas y prevenir la diferenciación hacia tejidos no deseados.

A pesar de que las MSCs son la estirpe celular más estudiada en ingeniería tisular de cartílago articular, fuentes adicionales continúan siendo exploradas. Tal fuente son las iPSC, obtenidas a partir de reprogramación de células adultas hacia estadíos iniciales de diferenciación, parecidas a las ESCs (86-89). Esta tecnología podría ser utilizada para “rejuvenecer” células de pacientes adultos hacia iPSCs y mejorar la capacidad de reparación y función de las células progenitoras. De hecho, estudios sugieren que el potencial condrogénico de las iPSCs (90)(91) es mayor que el de MSCs derivadas de médula ósea (92-94). En estudios experimentales con ratones y ratas, el uso de iPSCs demostró una eficiente reparación de las lesiones osteocondrales (94)(95); no obstante, estas células, debido a su reprogramación celular, han presentado modificaciones genéticas no deseables con riesgo de malformaciones (86)(96). Un estudio efectuado en ratones ha demostrado la formación de teratomas inmaduros en un grupo tratado con iPSCs 75% genéticamente homólogos (95). Con el avance de las técnicas en reprogramación celular, es posible generar iPSCs usando un abordaje libre de integración genética, el cual será más seguro desde una perspectiva regulatoria para su eventual uso clínico (97)(98). A pesar de esta disminución del riesgo, se necesitan más estudios para evaluar su benefico a largo plazo.

Futuras Aplicaciones con Bioimpresión

La bioimpresión está emergiendo como un instrumento clave para futuros abordajes de terapia biológica porque permite crear estructuras tisulares 3D “capa por capa” o de forma continua, según la impresora que se utilice (99). SE pueden imprimir diferentes materiales, hidrogeles y células entre otros componentes funcionales. Además, la creación de estructuras con diferentes gradientes de dureza que semejan al cartílago y al hueso permiten recrear el microambiente tisular. La habilidad de reproducir precisamente la plétora de formas condrales para luego limitar la resección de cartílago en las cirugías de reparación puede rendir mayores resultados quirúrgicos con una mínima remoción de cartílago sano (100-103). Más ambiciosa es la posibilidad de remodelar superficies articulares de forma completa, en casos de enfermedad generalizada como en la artrosis. Mimetizando la forma anatómica, con propiedades biomecánicas similares y la potenciación biológica que se está llevando a cabo en estudios experimentales (104). Moutos et al. (104) describieron la formación de cartílago funcional sobre una plataforma 3D entrelazada utilizaga para remodelar la superficie total articular, con competencia biológica para proteger articulaciones enfermas de la inflamación por medio de expresión de moléculas antiinflamatorias.

La combinación de hidrogeles condrogénicos con estructuras bioimpresas 3D previa a la inoculación del hidrogel, dentro del defecto a tratar, podría ser una terapia prometedora. Las estructuras 3D permiten aportar una plataforma mas fuerte hasta que el hidrogel con MSCs puedan regenerar el defecto. Además, estas estructuras impresas 3D podrían asistir en la integración del hidrogel al hueso subcondral y tejido circundante (104)(105). La técnica propuesta consiste en la inyección del precursor del hidrogel entre las estructuras 3D impresas (Figura 5) (Figura 6).

Hidrogeles en patología osteoarticular

En un futuro, los hidrogeles podrían ser utilizados para reparar diferentes estructuras musculo-esqueléticas como meniscos, labrum y hueso entre otras. Sin embargo, esta revisión la hemos focalizado al uso de hidrogeles para la reparación de cartílago, especialmente lesiones condrales focales. Es importante recalcar que para expandir el alcance del uso de hidrogeles en diferentes tejidos musculoesqueléticos, los principales componentes del mismo tendrían que adaptarse según las características biológicas del tejido a regenerar. La aplicación más inmediata de los hidrogeles sería para el tratamiento de lesiones condrales focales. Clínicamente, se han utilizado hidrogeles condrogénicos en combinación a la microfractura para el tratamiento de lesiones de cartílago articular (37). La idea propuesta es utilizar estos hidrogeles a modo de sello en el sitio de la microfractura. Una vez que esta se realiza, los hidrogeles agregan un estimulo condrogénico y permiten mantener en el lugar el coagulo y las células madre endógenas (37) (106). No se han efectuado estudios clínicos utilizando hidrogeles condrogénicos para el tratamiento de lesiones condrales focales o para la bioimpresión. Numerosos puntos deben abordarse a través de la medicina previa a su implantación en pacientes. Estos incluyen mejorar la información en base a su tiempo de biodegradación, el uso ideal de biomaterial para la regeneración y reproducir el gel para rellenar morfológicamente el defecto. Adicionalmente, el ambiente biológico necesita ser optimizado con las líneas celulares más propicias, factores de crecimiento y agentes anti-inflamatorios.

Los hidrogeles biodegradables y biomiméticos tienen multiples ventajas para el tratamiento de lesiones condrales y la artrosis temprana. Estas incluyen su capacidad de ser inyectados, polimerización in situ controlada y tiempos de degradación controlada que equiparan los tiempos de formación de tejido nuevo. Un área prometedora es su habilidad de aportar señales condrogénicas que estimulen la diferenciación de células madre endógenas o exógenas. Diferentes investigadores deberían continuar estudiando el potencial de MSCs e iPSCs dentro de los hidrogeles dado sus resultados experimentales. Por último, la habilidad de utilizar hidrogeles para la bioimpresión ofrece la oportunidad de imprimir estructuras que más se asemejan a la arquitectura nativa y que eventualmente permitirá formar la superficie de una articulación entera. Los hidrogeles continuarán evolucionando con la esperanza de que su uso impactará en la reparación de cartílago articular.

 

Conflicto de intereses

Dr. Pascual-Garrido recibe apoyo para la investigación a través de Biomet-Zimmer y AOSSM-SANOFI. El resto de los autores declaran no tener actual o potencial conflicto de intereses en relación a este artículo.

Agradecimientos

Agradecemos el aporte teórico y técnico de los siguientes autores para la realización de este artículo: Stephanie J. Bryant, PhD; Aisenbrey A. Elizabeth; Payne A. Karin, PhD (Department of Orthopedics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, Aurora, CO, Estados Unidos); y Laurie R Goodrich, DVM, PhD (Department of Clinical Sciences and Orthopaedic Research Center, Colorado State University, Fort Collins, CO, Estados Unidos); con quienes trabajamos en conjunto con el hidrogel de condroitín sulfato y polietilenglicol an distitintos estudios animales que estamos desarrollando. El mismo hidrogel desarrollado y extensamente estudiado por SJB y AAE (Department of Chemical & Biological Engineering, University of Colorado Denver, Boulder, CO, Estados Unidos).

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